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His標簽純化介質產品說明書

發布日期:2017-01-07

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Ni Bestarose 6Fast Flow

Ni Bestarose High Performance

1、簡介

    瓊脂糖親和介質(Ni)是將金屬離子Ni2+螯合在瓊脂糖凝膠上形成的一種親和層析介質,具有吸附容量大、選擇型好、易于再生、成本低等優點,廣泛用于生物制藥和生物工程下游蛋白質及多肽的分離純化,尤其是組氨酸標記蛋白質的高效純化。                                                                                                                                                                                   

2、介質性質

●   瓊脂糖濃度

6%

●   介質平均顆粒

34μm ( Ni Bestarose High Performance) 90μmNi Bestarose 6 Fast Flow

●   功能基團

Ni2+

●   結合載量

40mg His標簽蛋白/ml介質

●   建議pH范圍

3-12(工作),2-14(短期)

●   推薦流速

150cm/h(最大)

●   化學穩定性

40 ℃放置一周:0.01M HCl,0.1M NaOH;

12h1M NaOH,70%乙酸;

●   存放條件

4-30℃

●   運輸與儲存溶液

20%乙醇                                                                                                                                                                                                  

3、建議實驗條件

3.1 結合、清洗緩沖液的選擇

適用于His標簽純化過程的緩沖液首選磷酸鹽緩沖液,pH范圍在中性(7-8之間),避免適用EDTA及檸檬酸鹽。

結合緩沖液需要含有低濃度的咪唑,這可以減少宿主蛋白同介質的非特異結合,同時樣品中也要加入相同濃度的咪唑。

清洗緩沖液中含盡可能高的咪唑濃度可以增加重組histidine-tagged蛋白的純度,但是該濃度條件下,不能把histidine-tagged蛋白洗脫下來。

3.2 樣品的準備

在層析過程中,需要準備符合層析要求的樣品溶液。

樣品緩沖液應盡可能與結合緩沖液 一致。固體樣品可用結合緩沖液溶解配制;低濃度樣品溶液可用結合緩沖 透析;高濃度樣品溶液可用結合緩沖液稀釋。重組histidine-tagged蛋白以包涵體的形式表達,可以在緩沖液中加入6M鹽酸胍或8M尿素。當使用鹽酸胍或尿素時,蛋白會解折疊,在柱上或洗脫后蛋白解折疊,這取決于不同的蛋白。為了避免堵塞層析柱,樣品應經離心或微濾(0.45μm或者是0.22μm)處理。

3.3 洗脫

3.3.1 可通過提高咪唑的濃度進行洗脫。

3.3.2 可降低緩沖液的pH進行洗過,當緩沖液pH降低至4以下時,金屬離子會同介質解離從而達到洗脫目的。(如果目的蛋白對低pH敏感,建議洗脫液中加入1/10體積的1M Tris-HCl,pH9.0進行中和

3.3.2 螯合劑EGTAEDTA可將金屬離子同介質解離而達到洗脫目的,洗脫產物中的Ni2+可用脫鹽柱去除。介質可用0.1M NiSO4再次飽和后使用。

4、應用舉例

例一:

圖一  Ni-FF分離純化His標簽蛋白

層析柱:EzFast 1 ml

樣品:大腸桿菌BL21裂解液上清

結合緩沖液:20mM PB 0.5 M NaCl 20mM咪唑, pH 7.6

洗脫緩沖液:20mM PB 0.5 M NaCl 500mM咪唑, pH 7.6

5、穩定性

    His標簽介質在所有常用緩沖液中保持穩定。若要長期保存,需要浸泡在20%乙醇中并儲藏于4-8℃條件下。

6、再生和在位清洗(CIP

    6.1 再生

    6.1.12-5倍介質體積脫鎳緩沖液(50mM PB,300mM NaCl,100mM EDTA,pH 8.0)過柱子;

    6.1.25-10倍介質體積0.5M NaOH過柱,適當調整流速,保證介質與NaOH溶液接觸時間達到30min以上;

    6.1.310倍介質體積去離子水洗柱;

    6.1.43倍介質體積0.5M NaAC pH4.0緩沖液平衡柱子;

    6.1.53倍介質體積0.1M NiSO4過柱;

    6.1.63倍介質體積0.5M NaAC pH4.0緩沖液洗柱;

    6.1.75倍介質體積平衡緩沖液平衡柱子。

6.2 在位清洗

    6.2.1除去因離子交換作用吸附的蛋白,用2-3倍柱床體積的2M NaCl溶液清洗柱子,再用平衡緩沖液清洗柱子;

    6.2.2除去蛋白沉淀、疏水性蛋白,用1M NaOH100cm/h的流速清洗柱子1h;

    6.2.3除去強的疏水性蛋白和脂質等,用4倍柱床體積的70%乙醇或者30%異丙醇洗柱子,再用平衡緩沖液平衡柱子。

7、儲存

His標簽純化介質保存在含有20%乙醇溶液中,4-8℃下長期保存。

 

 

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